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动物功能基因表达虚拟仿真模块

来源:         作者:         发布日期:2019-06-27     浏览次数:

     

  动物功能基因组表达虚拟仿真模块学习实训入口:http://vlab-dwgy.nwafu.edu.cn/dwgy/index.jsp

 

  动物功能基因表达虚拟仿真实验模块内容包括核酸提取与检测,PCR 技术, DNA 酶切与连接,重组质粒转化与提取,原代细胞分离与培养,细胞冻存与复苏, 细胞转染,表达效果检测八个虚拟仿真项目。本模块从动物功能基因出发,设计 引物通过 PCR 技术实现目的基因扩增,经酶切连接后获得重组载体,利用细胞转 染技术实现功能基因在离体培养的原代细胞中表达。通过本模块,学生将全方面了解整个动物功能基因表达实验的操作流程及注意事项,并高效完成该流程的实践操作。

  (1)核酸提取与检测。核酸是动物体内具有重要生物化学功能的生物大分子,分为脱氧核糖核酸 (DNA)和核糖核酸(RNA)两大类,其中 DNA 是遗传信息的携带者,与动物体的 生长,繁殖,遗传和变异有密切的关系,RNA 参与蛋白质的生物合成过程。通过 本实验,学生将掌握动物体基因组 DNA 与组织总 RNA 的提取方法和检测技术。利 用 VR 虚拟平台,学生可以操作动物体组织分离,细胞破碎,离心沉淀,核酸纯 化,核酸电泳,紫外吸收定量等实验步骤,比较和分析基因组 DNA 与组织总 RNA 的提取方法和检测技术的相同点和不同点。 

  (2)PCR 技术。聚合酶链式反应(PCR)技术是一种用于体外扩增特定的 DNA 片段分子生物 学技术。PCR 技术主要过程是通过人工合成的一小段单链 DNA 片段与模板 DNA 特 定的区域特异性结合,进而以四种 dNTP 为底物,通过 DNA 聚合酶沿着引物和模 板形成的双链部分的 3’端聚合形成 DNA 片段实现 DNA 体外扩增的过程。通过实 验,学生将全面掌握 PCR 技术的原理和方法。利用 VR 虚拟平台,学生可以操作 引物设计,PCR 体系构建,PCR 程序设置,PCR 产物电泳检测和 PCR 产物回收等 实验步骤,系统分析目的基因扩增引物设计的原则,提高 PCR 扩增效率的因素。

  (3)DNA 酶切和连接。利用限制性内切酶切割 DNA 和利用DNA连接酶连接 DNA是DNA重组过程中的 关键步骤之一。成功的酶切和有效的连接为后续目的基因进入宿主细胞进行表达 提供了有效的实验材料。通过本实验,学生将全面掌握 DNA 酶切和 DNA 连接技术 的原理和方法。利用 VR 虚拟平台,学生可以操作学习限制性内切酶的种类和选 择,载体的种类和选择,酶切体系的建立,DNA 连接酶选择,连接体系的建立等 实验步骤,全面掌握限制性内切酶和 DNA 连接酶的作用特点和操作方法。 

  (4)重组质粒转化和提取。经酶切连接而成的重组载体需转化大肠杆菌细胞,筛选阳性单菌落后大量扩 繁,利用碱裂解法大量制备重组质粒,为后续细胞转染提供实验材料。通过本实 验,学生将全面掌握重组质粒转化和筛选,重组质粒提取的原理和方法。利用 VR 虚拟平台,学生可以操作大肠杆菌感受态细胞的制备,细胞转化的方法和选 择,阳性单菌落的鉴定,质粒大量制备等实验步骤,系统掌握 CaCl2 法细菌转化 技术,蓝白斑筛选阳性重组质粒单菌落,碱裂解法提取质粒 DNA 的原理和方法。

  (5)原代细胞分离与培养。细胞培养是模拟机体内生理条件,将细胞从机体中取出,在人工条件下使其 生存、生长、繁殖和传代,进行细胞生命过程、细胞癌变、细胞工程等问题的研 究。由体内直接取出组织或细胞进行培养叫原代培养。原代培养细胞离体时间短, 性状与体内细胞更相似,在一定程度上可以反映体内状态。通过本实验,学生将 掌握原代细胞分离,培养和鉴定的基本方法。利用 VR 虚拟平台,学生可以学习 并操作组织分离,细胞悬液制备,原代细胞纯化,换液,原代细胞鉴定等实验步 骤,系统掌握细胞培养无菌操作技术,原代细胞分离和培养的操作要点,以及细 胞类型的鉴定技术。 

  (6)细胞冻存与复苏。细胞冻存与细胞复苏实验是细胞培养的常规操作过程。细胞冻存与细胞传代 保存相比,可以减少人力,经费,减少污染,减少细胞生物学特性变化。细胞冻 存及复苏的基本原则是慢冻快融,可以最大限度的保存细胞活力。通过本实验, 学生将掌握细胞冻存和细胞复苏的基本方法。利用 VR 虚拟平台,学生可以学习 细胞冻存剂类型,操作细胞冻存,细胞复苏,细胞传代等实验步骤。 

  (7)细胞转染。转染是将外源性基因导入细胞内的一种专门技术。随着基因与蛋白功能研究 的深入,转染目前已成为实验室工作中经常涉及的基本方法。转染大致可分为物 理介导、化学介导和生物介导三类途径。电穿孔法、显微注射和基因枪属于通过 物理方法将基因导入细胞的范例;化学介导方法很多,如经典的磷酸钙共沉淀法、 脂质体转染方法、和多种阳离子物质介导的技术;生物介导方法,常见的有各种 病毒介导的转染技术。通过本实验,学生将掌握细胞转染的基本原理和方法。利 用 VR 虚拟平台,学生可以学习和比较不同细胞转染方法的原理和特点,操作脂 质体和病毒介导的细胞转染基本过程。 

  (8)基因表达效果检测。荧光定量 PCR 技术和 Western blot 技术常用于核酸水平和蛋白质水平检测 目的基因的表达情况。荧光定量 PCR 通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针, 对 PCR 产物进行标记跟踪,实时在线监控反应过程,结合相应的软件可以对产物 进行分析,计算待测样品模板的初始浓度。Western blot 技术首先将 PAGE 电泳 分离后的细胞或组织总蛋白质从凝胶转移到固相支持物 NC 膜或 PVDF 膜上,然后 用特异性抗体检测某特定抗原,再与酶或同位素标记的第二抗体起反应,经过底 物显色或放射自显影以检测特异性目的基因表达的蛋白成分。通过本实验,学生 将掌握核酸水平和蛋白质水平检测目的基因表达的方法。利用 VR 虚拟平台,学 生可以学习荧光定量 PCR 和 Western blot 技术的原理,操作细胞 RNA 的提取, 逆转录,荧光定量 PCR 体系搭建,细胞总蛋白提取,SDS-PAGE,转膜,孵育,显 色等实验过程,掌握荧光定量 PCR 和 Western blot 技术从核酸水平和蛋白质水 平检测目的基因表达的原理和方法。 

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